国际肿瘤学杂志 ›› 2023, Vol. 50 ›› Issue (7): 407-412.doi: 10.3760/cma.j.cn371439-20230404-00079
吴旻杭1, 孙文政2, 于庆卓2, 郭蓉2, 叶辉3, 杜莹3, 邱晋2, 安华章2(), 曹莉莉1,2,3()
Wu Minhang1, Sun Wenzheng2, Yu Qingzhuo2, Guo Rong2, Ye Hui3, Du Ying3, Qiu Jin2, An Huazhang2(), Cao Lili1,2,3()
摘要:
目的 探讨环指蛋白43(RNF43)对黑色素瘤中CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应的调节作用。方法 利用慢病毒感染技术对小鼠黑色素瘤细胞株B16-OVA进行RNF43基因过表达与敲低;通过小鼠皮下成瘤实验检测Lv-Ctrl-OE组、Lv-RNF43-OE组、Lv-Ctrl-KD组和Lv-RNF43-KD组小鼠黑色素瘤细胞株B16-OVA体内增殖情况,通过流式细胞术检测黑色素瘤肿瘤免疫微环境中CD8+ T细胞穿孔素和γ干扰素(IFN-γ)的表达水平;采用实时荧光定量PCR实验检测细胞中β-catenin和程序性死亡受体配体1(PD-L1) mRNA的表达水平;通过双荧光素酶报告基因实验检测RNF43对PD-L1的转录调控作用。结果 本研究成功构建RNF43稳定过表达与敲低的小鼠黑色素瘤细胞株Lv-RNF43-OE和Lv-RNF43-KD。小鼠皮下成瘤实验结果显示,Lv-RNF43-OE组瘤体质量为(0.08±0.06)g,明显小于Lv-Ctrl-OE组的(1.04±0.52)g,差异有统计学意义(t=3.71,P=0.032);Lv-RNF43-KD组瘤体质量为(1.94±0.29)g,与Lv-Ctrl-KD组的(1.15±0.74)g相比差异无统计学意义(t=-1.70,P=0.164)。流式细胞术结果显示,Lv-RNF43-OE组CD8+ T细胞穿孔素荧光强度为9 034±2 628,明显高于Lv-Ctrl-OE组的3 847 ±1 637,差异有统计学意义(t=-3.35,P=0.015);Lv-RNF43-KD组CD8+ T细胞穿孔素荧光强度为966±247,明显低于Lv-Ctrl-KD组的2 226±646,差异有统计学意义(t=3.16,P=0.034);Lv-RNF43-OE组CD8+ T细胞IFN-γ荧光强度为2 422±429,明显高于Lv-Ctrl-OE组的1 688±324,差异有统计学意义(t=-2.73,P=0.034);Lv-RNF43-KD组CD8+T细胞IFN-γ荧光强度为614(454,863),与Lv-Ctrl-KD组的1 159(1 152,2 068)相比差异有统计学意义(Z=-1.96,P=0.050)。实时荧光定量PCR实验结果显示,Lv-RNF43-OE组β-catenin mRNA相对表达量为0.67±0.16,明显低于Lv-Ctrl-OE组的1.00±0.11,差异有统计学意义(t=2.98,P=0.041);Lv-RNF43-OE组PD-L1 mRNA相对表达量为0.32±0.09,明显低于Lv-Ctrl-OE组的1.00±0.09,差异有统计学意义(t=9.13,P=0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,pCMV6-NC组、RNF43组、RNF43+β-catenin组和β-catenin组PD-L1启动子荧光素酶活性分别为1.00±0.00、0.84±0.00、1.49±0.00和1.57±0.03(F=2 218.33,P<0.001),进一步两两比较发现,与pCMV6-NC组相比,RNF43组PD-L1启动子荧光素酶活性明显降低(P<0.001),RNF43+β-catenin组和β-catenin组PD-L1启动子荧光素酶活性明显升高(P<0.001;P=0.003);与RNF43组相比,RNF43+β-catenin组PD-L1启动子荧光素酶活性明显升高(P<0.001)。结论 RNF43可能通过抑制β-catenin的表达降低黑色素瘤中PD-L1 mRNA的表达并促进CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。